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Comunicaciones ISME volumen 3, Número de artículo: 84 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

La investigación sobre comunidades microbianas marinas está creciendo, pero los estudios son difíciles de comparar debido a la variación en los protocolos de muestreo del agua de mar. Para ayudar a los investigadores en la intercomparación de estudios que utilizan diferentes metodologías de muestreo de agua de mar, así como para ayudarlos a diseñar futuras campañas de muestreo, desarrollamos la iniciativa EuroMarine Open Science Exploration (EMOSE). En el marco de EMOSE, tomamos muestras de miles de litros de agua de mar de una sola estación en el noroeste del Mediterráneo (Service d'Observation du Laboratoire Arago [SOLA], Banyuls-sur-Mer), durante un solo día. El conjunto de datos resultante incluye múltiples enfoques de procesamiento de agua de mar, que abarcan diferentes tipos de filtros (membrana de cartucho y membrana plana), tres fraccionamientos de diferentes tamaños (>0,22 µm, 0,22–3 µm, 3–20 µm y >20 µm) y varios volúmenes de agua de mar diferentes que van desde 1 L hasta 1000 L. Mostramos que el volumen de agua de mar que se filtra no tiene un efecto significativo sobre la diversidad de procariotas y protistas, independientemente de la estrategia de secuenciación. Sin embargo, hubo una clara diferencia en la diversidad alfa y beta entre las fracciones de tamaño y entre éstas y el “agua entera” (sin prefraccionamiento). En general, recomendamos tener cuidado al fusionar datos de conjuntos de datos que utilizan filtros de diferentes tamaños de poro, pero consideramos que el tipo de filtro y el volumen no deben actuar como variables de confusión para las estrategias de secuenciación probadas. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que un conjunto de datos disponible públicamente permite de manera efectiva aclarar el impacto de las opciones metodológicas del microbioma marino en una amplia gama de protocolos, incluidas variaciones a gran escala en el volumen de muestra.

La caracterización de la vida microbiana en la Tierra se ha convertido en un tema de interés transdisciplinario. De hecho, ahora se reconoce que adquirir conocimientos sobre ecología microbiana en múltiples biomas es crucial para desarrollar una comprensión más profunda de la vida, desde las células hasta los ecosistemas. Como resultado, grandes proyectos de investigación colaborativa internacional se han centrado en microbiomas asociados con humanos [1, 2], corales [3], pastos marinos (https://seagrassmicrobiome.org/protocols/) o esponjas [4, 5]. Además, en los últimos 20 años, se han lanzado iniciativas globales coordinadas de muestreo de microbiomas planctónicos marinos, como el Global Ocean Sampling (2003-2010) [6, 7], el Censo Internacional de Microbios Marinos (ICoMM) [8], Expedición de circunnavegación de Malaspina 2010 [9] y expediciones al océano Tara (2009-2012) [10], junto con programas de censo como el programa del Microbioma de la Tierra [11, 12] y el Día de muestreo del océano (OSD) dirigido por Micro B3 [13 ]. Los detalles sobre los avances y perspectivas sobre la ecología microbiana oceánica global, su relevancia y los desafíos futuros se han revisado exhaustivamente en otros lugares [14].

El enorme esfuerzo actual para estudiar los microbiomas del mundo ha dado lugar a múltiples iniciativas de estandarización, incluido el uso de protocolos comunes para tomar muestras del microbioma de diferentes entornos y tejidos huéspedes, y de procedimientos de secuenciación comunes. Las iniciativas relevantes con esfuerzos de estandarización metodológica incluyen, por ejemplo, OSD [13], Earth Microbiome [15], European Marine Omics Biodiversity Observatory Network (EMO BON) [16] y Metagenómica para el tracto intestinal humano (MetaHIT) [17].

El análisis a gran escala de los microbiomas de vida libre y asociados al huésped constituye un gran paso adelante en la comprensión de las interacciones microbios-animales [3, 5, 18, 19] y microbios-plantas [20], así como la estructura, función y Diversidad de comunidades microbianas en diversos hábitats de la Tierra [21]. Sin embargo, es necesario colmar las lagunas para estandarizar y armonizar mejor las mejores prácticas y estrategias para muestrear, describir y estudiar la diversidad microbiana. En particular, en los estudios del microbioma oceánico, se sabe que la estimación de la riqueza microbiana depende de varios factores, incluidos los genes marcadores y los cebadores utilizados para la codificación de metabarras [22], los diferentes protocolos de extracción de ADN [23, 24], la profundidad de secuenciación y las características genómicas. enfoque (secuenciación de amplicones versus secuenciación de metagenomas) y criterios de agrupación [25]. Aunque se reconoce que la estrategia de muestreo influye en las estimaciones de la diversidad del plancton microbiano [25], faltan estudios diseñados para probar sistemáticamente el efecto de las variables metodológicas en los procedimientos de muestreo para estudiar la diversidad del microbioma del océano y la composición taxonómica. Estos estudios son cruciales para diseñar protocolos precisos para muestrear todo el rango de tamaños de comunidades microbianas marinas [26].

Para estudiar los microbios marinos, es necesario recolectar agua de mar y luego concentrar las células mediante filtración. El volumen filtrado suele estar en el rango de 0,5 L, 1 L, 3–10 L y 100 L (p. ej., [7, 27,28,29]) o hasta que el filtro se obstruya, dependiendo de las partículas de sedimento presentes, la materia orgánica detritos, biomasa celular y/o microalgas en crecimiento [30]. Así, según el estado trófico del sistema, sus condiciones hidrográficas y la proximidad a fuentes de escorrentía terrestres, podrían ser necesarios diferentes volúmenes de agua o agregar un paso de prefiltración. Es poco común utilizar un volumen en el rango de microlitros, pero se ha utilizado, por ejemplo, para probar interacciones bacteria-bacteria en escalas milimétricas [31]. A menudo es posible encontrar variaciones en el volumen filtrado dentro del mismo estudio, por ejemplo, debido a limitaciones metodológicas in situ, por ejemplo, [29], o para muestras destinadas a diferentes propósitos, como la recolección de ADN y ARN, por ejemplo, [ 32]. Además, existen dos tipos principales de filtros ampliamente utilizados por la comunidad científica: (1) filtros de membrana de cartucho, con un tamaño de poro de 0,22 μm; y (2) filtros de membrana plana, que también se pueden utilizar para fraccionamiento por tamaño. Los filtros de membrana plana también se diferencian en el material que lo componen (polietersulfona, policarbonato, celulosa, etc.), lo que afecta a sus propiedades [33]. Un estudio anterior comparó los resultados de la secuenciación de amplicones de los genes de ARNr 16 S, 18 S y 12 S para cinco filtros de membrana plana con diferentes composiciones y no encontró diferencias significativas [34]. Otro estudio, sin embargo, destacó que diferentes materiales de filtro y protocolos de extracción de ADN pueden introducir una detección falsamente negativa de unidades taxonómicas operativas (OTU) microeucariotas y subestimar la diversidad [35]. El fraccionamiento por tamaño se utiliza para separar las células microbianas por tamaño [36, 37], seleccionando así procariotas de microeucariotas más grandes y discriminando las células de vida libre de las unidas a partículas. Clásicamente, las muestras se dividen en fracciones de tamaño de picoplancton (0,2 a 3 µm), nanoplancton (3 a 20 µm) y microplancton (20 a 200 µm), según la división histórica de las fracciones de tamaño planctónico [38]. Sin embargo, existen variaciones entre los diferentes estudios, por ejemplo, seleccionando picoplancton en el rango de 0,8 a 3 µm [39]. Estudios anteriores han abordado la distribución de microeucariotas en fracciones de tamaño, observando que el fraccionamiento por tamaño puede introducir artefactos del colapso celular y la posterior retención en fracciones de tamaño más pequeño [40]. Además, variables como la forma y la etapa del ciclo de vida de los protistas pueden dar como resultado la identificación de la misma especie en fracciones de diferentes tamaños, como se observa en el caso de las diatomeas [39].

En el marco de la iniciativa EMOSE 2017, tomamos muestras de agua de un sitio costero del noroeste del Mar Mediterráneo (SOLA) y construimos un conjunto de datos único de metagenomas profundamente secuenciados y amplicones del gen 16 S/18 S rRNA (MetaB16SV4V5 y MetaB18SV9). Hasta donde sabemos, este conjunto de datos representa el mayor esfuerzo de secuenciación jamás realizado en un solo sitio en un solo día. El experimento fue diseñado para comparar diferentes volúmenes de filtración, tipos de filtros, fraccionamientos de tamaño y estrategias de secuenciación utilizadas anteriormente en algunas de las iniciativas oceánicas globales más relevantes, es decir, Tara Oceans [10], Malaspina [9] y OSD [13].

El muestreo EMOSE fue diseñado para evaluar cómo cambian las estimaciones de diversidad microbiana con (i) cambios en el volumen de agua de mar filtrada, (ii) diferentes tipos de filtros (10 L de agua en cartuchos de 0,22 µm versus filtros de membrana plana), (iii) filtración de agua completa versus fraccionamiento por tamaño (10 L de agua en filtros de membrana plana); (iv) fracciones de diferentes tamaños (filtros de tamaño de poro de 100 l a 20 µm, 3 µm y 0,22 µm); y (v) un único filtro de 2,5 L frente a 4 filtros agrupados de 2,5 L (tamaño de poro de 0,22 µm, agua entera, membrana de cartucho). Todas las comparaciones antes mencionadas se consideraron de forma independiente para MetaB16SV4V5, MetaB18SV9 y metagenómica, para procariotas y protistas. Tenga en cuenta que varios estudios incluyen virus y hongos en su definición de "microbioma", por ejemplo, [14]. A los efectos de este artículo, solo consideramos procariotas y eucariotas unicelulares, a menos que se indique lo contrario.

El tamaño, la singularidad y la accesibilidad del conjunto de datos EMOSE tienen un gran potencial para ayudar a aclarar el impacto de las diferencias metodológicas entre los estudios y contribuir a la estandarización de los procedimientos aplicados. También es de código abierto y está disponible gratuitamente y permitirá realizar más investigaciones más allá del alcance de este estudio.

El muestreo se realizó en un único lugar, la estación SOLA (42°29'300 N – 03°08'700 E) en la bahía de Banyuls-sur-Mer (NO Mar Mediterráneo), a bordo del buque de investigación RV Nereis II de la Observatorio Oceanológico de Banyuls-sur-Mer (OOB). Se recolectaron un total de 75 bombonas de 20 L en un solo día (2017–05–30) del agua subterránea (3 m de profundidad) utilizando una bomba de pozo de alto volumen durante aproximadamente 45 minutos. Los contenedores de bombonas se dividieron en diferentes estrategias de muestreo de agua de mar para minimizar el sesgo de muestreo causado por la deriva de los barcos y la variación diurna. Los contenedores de bombona utilizados para almacenar el agua de mar se lavaron con lejía diluida (10% v/v) el día anterior y se enjuagaron minuciosamente dos veces con muestra de agua antes de llenarlos.

La filtración de agua se realizó siguiendo varios protocolos de muestreo de agua de mar (Fig. 1 y Tabla complementaria S1). Para el análisis del volumen total de agua recolectada: se filtró 1 L a través de un filtro de membrana de un solo cartucho de 0,22 µm; 2,5 L a través de un filtro de membrana de un solo cartucho de 0,22 µm; 10 L a través de un único filtro de membrana plana de 0,22 µm. Para el análisis de las fracciones de tamaño, los microbios se recolectaron mediante filtración seriada a través de tres filtros de tamaños de poro decrecientes, de acuerdo con los siguientes procedimientos: 10 L a través de un filtro de malla de 20 µm seguido de filtros de membrana plana de 3 µm y 0,22 µm; 100 L a través de un filtro de malla de 20 µm, seguido de filtros de membrana plana de 3 µm y 0,22 µm. Todos los filtros se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron en un congelador a -80 °C.

Se intentó tener al menos tres réplicas de cada paso, sin embargo, algunos pasos perdieron réplicas y/o volumen, esas situaciones se resaltan con un signo de atención en esta figura. Para obtener más detalles sobre las réplicas, consulte la Tabla complementaria S1.

Los protocolos para la filtración por membrana de cartucho se realizaron con el uso de la unidad de filtración por membrana de cartucho Sterivex (Código de producto SVGPB1010, Millipore) con una membrana de polietersulfona, mientras que los protocolos para la filtración por membrana de toda la comunidad de agua (>0,22 µm) y de 0,22 µm Para fracciones de tamaño de 3 µm se utilizaron filtros de membrana Express Plus de polietersulfona de 142 mm de diámetro (código de producto GPWP14250, Millipore). Para los fraccionamientos de 3 µm a 20 µm, se utilizaron filtros de membrana de policarbonato de 142 mm de diámetro (código de producto TSTP14250, Millipore). En cuanto a las fracciones de gran tamaño (>20 µm), se utilizó en su lugar el filtro de malla de nailon de 47 mm de diámetro (de ahora en adelante denominado membrana plana).

Siguiendo el esquema de muestreo en la Fig. 1 y la Tabla complementaria S1, el presente estudio analizó 79 muestras de agua de mar (n = 157, incluidas réplicas exitosas) de acuerdo con metodologías comúnmente aplicadas, ampliadas para incluir (y comparar) el uso de varios tipos de filtros, diferentes volúmenes de agua filtrada y la división del plancton en función de su tamaño (Tabla complementaria S1). Tenga en cuenta que algunas réplicas se perdieron durante la filtración de agua de mar, la extracción de ADN y/o la secuenciación. Remitimos al lector a la Tabla complementaria S1 para obtener información sobre la cantidad de réplicas obtenidas con éxito. Además, algunas muestras se descartaron durante la rarefacción debido al bajo número de lecturas (más detalles a continuación). Los metadatos relativos a cada muestra, incluidas las submuestras utilizadas para agrupar muestras de mayor volumen, se describen en detalle en la Tabla complementaria S2.

Una descripción completa de los siguientes protocolos para la producción de datos moleculares está disponible en Alberti et al. [41].

Brevemente, la extracción de ADN comenzó mediante criomolienda (SPEX SamplePrep 6870 Freezer/Mil, Fisher Scientific) los filtros con tampón de lisis y BSH, seguido de una columna de filtro XL (Macherey-Nagel), con tampón de lisis y BSH. La purificación se realizó con Nucleospin RNA II, con 1 volumen de filtrado e igual volumen de etanol (70% v/v), seguido de la elución del ADN con un juego de tampón de nucleopsina (Macherey Nagel). El ADN se cuantificó mediante un método de cuantificación fluorimétrico específico de dsDNA utilizando el fluorómetro Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific) con ensayos Qubit dsDNA BR (amplio rango) y HS (alta sensibilidad) y se almacenó a -20 °C.

Para la secuenciación de ADN (metagenoma), la preparación de la biblioteca se realizó utilizando un protocolo para entrada baja de ADN. Se sonicaron 10 ng de ADN total y se prepararon bibliotecas de secuenciación utilizando el kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext Ultra II para Illumina (New England BioLabs). Los fragmentos se repararon en los extremos, se agregaron adaptadores con código de barras de ADN NEXTflex y 3'adenilados según las instrucciones del fabricante. Después de dos limpiezas consecutivas con 1x Ampure XP (Fisher Scientific), los productos ligados se amplificaron por PCR con la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 (incluida en el kit), seguido de una purificación con 0,8x AMPure XP. Las bibliotecas preparadas se cuantificaron primero mediante la medición del ensayo Qubit dsDNA HS. Luego se realizó un análisis de perfil de tamaño en un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) y mediante qPCR con el kit de cuantificación de bibliotecas KAPA para bibliotecas Illumina (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, EE. UU.) en un instrumento MXPro (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Las bibliotecas se sometieron a secuenciación de Illumina en un instrumento HiSeq 4000 (Illumina), con un diseño de lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Se secuenciaron tres muestras con el instrumento Rapid HiSeq 4000, nuevamente utilizando el diseño de lecturas de extremos emparejados de 150 pb.

Para la secuenciación del amplicón de la región hipervariable V9 del gen 18 S rRNA (MetaB18SV9), el ADN se amplificó con los cebadores 1389 F 5'-TTGTACACACCGCCC -3' y 1510 R 5'- CCTTCYGCAGGTTCACCTAC -3' [42]. Se configuraron tres reacciones de PCR por muestra utilizando mezclas de PCR (volumen final de 25 μl) que contenían de 5 a 10 ng de plantilla de ADN total con una concentración final de 0,35 μM de cada cebador, 3 % de DMSO y 1X Phusion Master Mix. Las amplificaciones por PCR se realizaron de la siguiente manera: 98 °C durante 30 s; 25 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 57 °C, 30 s a 72 °C; y 72°C por 10 min. Luego, los productos de la PCR se combinaron y se purificaron mediante limpieza con perlas AMPure XP 1,8x (Beckman Coulter Genomics). Los productos de PCR variaron en longitud entre 170 y 180 pb. Se incluyó un control negativo (agua libre de nucleasas). Todas las bibliotecas se prepararon utilizando los productos de módulos de ADN NEBNext y los códigos de barras de ADN NextFlex con 100 ng de producto de PCR purificado como entrada y se secuenciaron utilizando la máquina HiSeq 2500 Rapid (Illumina) (lecturas de extremos emparejados de 150 pb). Se secuenciaron tres muestras con el instrumento MiSeq.

Para la secuenciación de amplicones de las regiones hipervariables V4-V5 del gen 16 S rRNA (MetaB16SV4V5), se amplificó el ADN con los cebadores 515 F (adelante: 5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') y 926 R (inverso: 5'-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT- 3') [22, 43,44,45]. Para cada muestra, se utilizaron seis reacciones utilizando las mismas mezclas de PCR que antes, con ciclos térmicos de 30 s a 98 °C, seguidos de 37 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 53 °C y 30 s a 72 °C. °C, finalizando con 10 min finales a 72 °C. Tenga en cuenta que estas condiciones de PCR cambiaron respecto a las de la ref. [23], porque la polimerasa utilizada era diferente. Luego, los productos de la PCR se combinaron y se purificaron con perlas AMPure 1x. El tamaño del producto de PCR varió de 300 pb a 700 pb. Todas las bibliotecas se prepararon utilizando los productos de módulos de ADN NEBNext y los códigos de barras de ADN NextFlex con 250 ng de producto de PCR purificado como entrada. Paralelamente se utilizó un control negativo (agua) y 16 comunidades simuladas: 8 comunidades simuladas de procariotas y 8 de eucariotas (proporcionadas por el laboratorio Jed Fuhrman, descrito en Parada et al. [22] y Yeh et al. [46] Después de la purificación de AMPure XP (1 volumen) y la cuantificación mediante medición fluorométrica Qubit (ensayo HS), se procesaron grupos equimolares de bibliotecas amplificadas en un gel de agarosa al 2 % (p/v) para seleccionar rodajas de gel de 500 a 650 pb (el tamaño del amplicón aumentó). (por adaptadores Illumina). Este paso de dimensionamiento separó los amplicones procarióticos 16 S de los productos de amplificación eucarióticos, que no fueron secuenciados en este estudio. La biblioteca dimensionada finalmente se purificó usando el kit de purificación de ADN Nucleospin Extract II. La secuenciación se llevó a cabo en un HiSeq Máquina rápida 2500, con lecturas de extremos emparejados de 250 pb. Se secuenciaron ocho muestras, junto con las respectivas comunidades simuladas, utilizando en su lugar una máquina MiSeq, con un modo de extremos emparejados de 2 × 300 pb. Tenga en cuenta que los resultados de secuenciación de las muestras son relativos a la lectura. La división de longitud y tamaño y las comunidades simuladas se pusieron a disposición del público, pero no se informaron en este artículo.

Los archivos FASTQ de las secuencias producidas se enviaron al Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA: Acceso PRJEB87662), donde están disponibles públicamente. Las lecturas sin procesar fueron procesadas por la plataforma MGnify [47]. Más específicamente, se utilizó la versión 5.0 para los datos de amplicones (MataB16SV4V5 y MetaB18SV9), mientras que se utilizó la versión 4.1 para los datos metagenómicos. Brevemente, las lecturas directas e inversas se fusionaron con SeqPrep v1.2, la calidad se filtró con Trimmomatic v0.36, se eliminaron las lecturas con menos de 100 pb y con más del 10% de ambigüedad de pb. Infernal v1.1.2 [48] se utilizó junto con Rfam 13.0 [49] para la identificación de genes de ARNr de SSU. Las lecturas de amplicones se atribuyeron directamente a linajes taxonómicos utilizando unidades taxonómicas operativas precalculadas con MAPSeq v1.2.3 [50] y la base de datos SILVA v132 [51]. Para los datos de metagenómica de escopeta, se utilizaron mOTU2 [52] con la base de datos SILVA v132 [51] para linajes taxonómicos. El número de lecturas en cada paso, para cada muestra y los respectivos números de acceso y enlaces están disponibles en la Tabla complementaria S3. A pesar de la reciente revisión en la taxonomía de microorganismos a nivel de filo y, por lo tanto, modificaciones sustanciales de la nomenclatura [53], utilizamos la información taxonómica proporcionada por la plataforma MGnify después de la base de datos SILVA v132 [51].

Las tablas con abundancia por linaje taxonómico y muestra se transfirieron directamente desde la plataforma MGnify al entorno de software R v3.6.3 [54]. Comenzamos dividiendo las secuenciaciones en procariotas y protistas. Específicamente, el MetaB16SV4V5 se filtró para incluir linajes taxonómicos atribuidos a procariotas. Eliminamos cualquier linaje taxonómico atribuido a orgánulos (mitocondrias y cloroplastos). Utilizando el mismo razonamiento, para el enfoque MetaB18SV9, nos centramos en los protistas y excluimos cualquier linaje taxonómico asignado a la taxonomía de procarióticos, metazoos, hongos o viridiplantae. Los datos metagenómicos se subdividieron en un conjunto de datos procarióticos y un conjunto de datos protistas, porque la secuenciación de todo el ADN sin sesgo de cebador permite identificar cualquiera de los grupos biológicos. No obstante, los consideramos grupos biológicos independientes y razonamos que sería más informativo separarlos. Esta separación se realizó después de la eliminación de cualquier linaje taxonómico asociado con orgánulos, metazoos, hongos y viridiplantae. Para cualquiera de los enfoques, se descartaron los linajes taxonómicos con taxonomía NA a nivel de Phylum. Luego se descargaron las tablas de abundancia para la curación manual de la taxonomía y agregar una columna de "rango falso" con la taxonomía relevante tanto de procariotas como de protistas. Para los protistas, nos centramos en los filos y las clases de mayor interés, mientras que para los procariotas el "rango falso" incluía todos los filos, pero las Proteobacterias se subdividieron por nivel de clase.

Después de la curación de la taxonomía, eliminamos los linajes taxonómicos únicos de los enfoques de secuenciación de amplicones (MetaB16SV4V5 y MetaB18SV9). La profundidad de secuenciación no fue homogénea entre las variables que pretendemos comparar directamente, lo que podría resultar en comparaciones sesgadas de diversidad, por lo que decidimos aplicar la rarefacción después de eliminar los singletons. El umbral de rarefacción se consideró individualmente para cada enfoque de secuenciación (MetaB16SV4V5, MetaB18SV9 y metagenomas) y grupo biológico (procariotas y protistas), porque son independientes y representan diferentes órdenes de magnitud de profundidad de secuenciación. Además, el umbral de rarefacción específico aplicado debería contrarrestar el costo de perder demasiadas lecturas de alta calidad frente a la pérdida de demasiadas muestras válidas. Específicamente, las muestras de MetaB16SV4V5 se enrarecieron a 250.000 lecturas y se descartaron tres muestras; las muestras de MetaB18SV9 se enrarecieron a 100.000 lecturas y se descartaron seis muestras; las muestras de metagenomas, considerando solo los linajes taxonómicos procarióticos, se enrarecieron a 10.000 lecturas y se descartaron 15 muestras; y las muestras de metagenomas, considerando linajes taxonómicos de protistas, se enrarecieron a 1000 lecturas y se descartaron cuatro muestras. Las muestras descartadas están disponibles en la Tabla complementaria S4.

Todos los análisis estadísticos se realizaron en el entorno de software R v3.6.3 [54]. Las métricas de diversidad alfa y beta se calcularon usando el paquete vegan v2.5.7 [55], todas las figuras, excepto la Fig. 1, se produjeron con el paquete ggplot2 v3.4.0 [56] o base R. Las pruebas estadísticas y sus suposiciones se probaron usando el paquete rstatix ​​v0.7.0 [57] y siguió las pautas para las mejores prácticas propuestas en [57]. La métrica de diversidad alfa utilizada fue el número total de linajes taxonómicos en una muestra determinada, es decir, la riqueza de especies. Decidimos utilizar una única métrica de diversidad alfa para simplificar la legibilidad de los resultados y la riqueza de especies seleccionadas porque es la métrica de diversidad alfa más sencilla. Esta métrica de diversidad alfa nos permite evaluar el resultado directo de las metodologías comparadas, lo que la convierte en la de propósito más general. Reconocemos que utilizar una única métrica de diversidad alfa sería muy reductivo en un entorno de investigación ambiental. Sin embargo, no hicimos inferencias sobre la ecología del sistema y varias métricas de diversidad alfa podrían ser redundantes entre sí. Para una verificación de cordura, verificamos que el índice de Shannon probablemente obtendría resultados similares, mientras que el índice de Simpson podría proporcionar resultados diferentes, según el análisis de correlación (Figura complementaria S1).

Decidimos utilizar pruebas estadísticas no paramétricas para comparar la riqueza de especies entre variables, debido al número limitado de muestras para comparaciones específicas. Para la comparación de dos grupos independientes, utilizamos la prueba de Mann-Whitney [58, 59]. Para más de dos grupos independientes, utilizamos la prueba de Kruskal-Wallis [59]. Los resultados estadísticamente significativos de Kruskal-Wallis fueron seguidos por la prueba post-hoc de Dunn [60]. Las pruebas se realizaron para comparaciones con al menos tres muestras replicadas por grupo independiente. Para cada prueba, especificamos si el valor de p era significativo o no (alfa = 0,05), luego de ajustar con el método de Bonferroni para comparaciones múltiples [61].

Para describir la diversidad beta, comparamos la disimilitud entre variables metodológicas. Para ello, utilizamos matrices de disimilitud de Bray-Curtis y visualizamos la distancia entre muestras con gráficos de ordenación, específicamente nMDS, con la función metaMDS del paquete vegano [55]. PERMANOVA calculó los valores significativos con la función adonis2 y la homogeneidad de la varianza se verificó con la función betadisper, ambos del paquete vegano [55]. Finalmente, se accedió a la significancia de la distancia al centroide con la prueba de Tukey, con funciones de base R.

Para los resultados de la secuenciación MetaB16SV4V5 (n = 60), inicialmente obtuvimos entre 714,103 y 2,841,890 lecturas sin procesar por muestra (mediana = 1,462,584 lecturas, IQR = 267,472 lecturas). El número final de lecturas de alta calidad atribuidas a linajes taxonómicos osciló entre 169.945 y 1.517.860 lecturas por muestra (mediana = 660.878 lecturas, IQR = 438.932 lecturas). Así, entre el 13,38% y el 72,47% de las lecturas se conservaron después del filtrado de calidad y el procesamiento en linajes taxonómicos (mediana = 50,69%, IQR = 30,47%). Los resultados de la secuenciación MetaB18SV9 (n = 47) obtuvieron entre 670.823 y 3.876.463 lecturas sin procesar por muestra (mediana = 1.322.612 lecturas, IQR = 319.425 lecturas). De esas lecturas, las lecturas finales de alta calidad procesadas en linajes taxonómicos oscilaron entre 66.912 y 1.889.838 lecturas por muestra (mediana = 1.733.379 lecturas, IQR = 348.105 lecturas). Así, entre el 6,21% y el 60,33% de las lecturas se conservaron después del filtrado de calidad y el procesamiento en linajes taxonómicos (mediana = 13,05%, IQR = 26,13%). Para los metagenomas (n = 50), obtuvimos entre 36 573 050 y 123 310 150 lecturas sin procesar por muestra (mediana = 58 122 461 lecturas, IQR = 12 863 822 lecturas). Se utilizó una fracción menor de las lecturas del metagenoma para la identificación taxonómica. Específicamente, para los procariotas, las lecturas del ARNr 16S oscilaron entre 628 y 98.749 (mediana = 23.376 lecturas, IQR = 43.212 lecturas), correspondiendo así a una proporción entre 0,0011% y 0,0976% (mediana = 0,0394%, IQR = 0,0664%) de la lectura final. vs lecturas iniciales sin procesar. Para los protistas, el rango de lecturas finales del ARNr 18S del metagenoma utilizado fue de entre 396 y 9160 lecturas (mediana = 2568 lecturas, IQR = 2807 lecturas), lo que corresponde a una proporción entre 0,0006% y 0,0121% (mediana = 0,0051%, IQR = 0,0046 %). Los valores de los resultados de la secuenciación se resumen en la Tabla complementaria S5, con métricas de centralidad adicionales.

Estimamos el número previsto de linajes taxonómicos para cada nivel de poder de secuenciación con curvas de rarefacción (Figura complementaria S2). MetaB18SV9 fue el único enfoque de secuenciación que alcanzó claramente la meseta de la curva de rarefacción, pero solo para las muestras de fracción de tamaño de 3 a 20 µm y debido a un mayor número de lecturas (Figura complementaria S2). Si bien el MetaB16SV4V5 no alcanzó una meseta clara en la curva de rarefacción, estuvo bastante cerca (Figura complementaria S2). Los metagenomas estaban más cerca de la meseta de la curva de rarefacción para los protistas que para los procariotas (Figura complementaria S2).

Se filtró una gama considerable de volúmenes de agua de mar, desde tan solo 1 L hasta 1000 L, utilizando varios tamaños de poro (agua entera con 0,22 µm, o fracciones de tamaño con 0,22–3 µm, 3–20 µm y >20 µm). Además, también se compararon los volúmenes completos de membranas de cartuchos de agua de 1 litro a 10 litros para los metagenomas. A continuación, consideramos los resultados de procariotas y protistas de forma independiente.

En la Fig. 2, ilustramos el número de linajes taxonómicos procarióticos obtenidos filtrando los diferentes volúmenes de agua de mar, separados por tipo de filtro (membrana de cartucho y membrana plana), tamaños de poro (agua entera y fracciones de tamaño) y estrategia de secuenciación (MetaB16SV4V5 y metagenomas). La visión amplia destaca la ausencia de un efecto claro del volumen filtrado (1 L a 1000 L) sobre el número de linajes taxonómicos procarióticos obtenidos, independientemente del tipo de filtro y del método de secuenciación (MetaB16SV4V5 y metagenoma) para el agua entera y la fracción 0,22. –3 µm. Para los filtros de membrana plana, el número de linajes taxonómicos procarióticos aumentó al aumentar el tamaño de los poros, pero no al aumentar el volumen (Fig. 2). Además, las curvas de rarefacción de MetaB16SV4V5 revelaron que el número de linajes taxonómicos procarióticos se dividió consistentemente por fracciones de tamaño (Figura complementaria S2), pero no por volumen (Figura complementaria S3). Se observaron las mismas diferencias para los metagenomas, pero solo con un número menor de lecturas (Figura complementaria S3). El número de linajes taxonómicos procarióticos obtenidos después de cada muestra está disponible en la Tabla complementaria S6.

La cuadrícula divide las posibles estrategias de secuenciación en filas (MetaB16SV4V5 o metagenoma) y la utilización de agua entera (>0,22 µm) o fracciones de tamaño (0,22–3 µm, 3–20 µm y >20 µm) en columnas. El color distingue entre filtros de membrana planos y de cartucho. Dentro de cada unidad de cuadrícula, la riqueza de especies procarióticas se representa en función del volumen, que oscila entre 2,5 L y 1000 L.

Para aclarar el efecto del uso de un solo filtro (agua entera) o varios filtros consecutivos (fracciones de tamaño) en el número de linajes taxonómicos procarióticos obtenidos, comparamos directamente muestras del mismo filtro (membrana) y volumen (10 L). Para MetaB16SV4V5, las muestras de agua entera (>0,22 µm) y de fracciones de tamaño de 0,22 a 3 µm presentaron un número similar de linajes taxonómicos procarióticos (Fig. 3a) y ambas presentaron menos linajes taxonómicos procarióticos que la fracción de tamaño de 3 a 20 µm (Fig. 3a). ). En consecuencia, la prueba estadística indicó diferencias significativas en la riqueza de especies obtenida después de > 0,22 µm, 0,22–3 µm y 3–20 µm (p < 0,05, Kruskal-Wallis), más específicamente, entre >0,22 µm y 3–20 µm de tamaño. fracciones (p < 0,05, prueba de Dunn post-hoc). En el lado de los metagenomas, para la misma comparación, no hubo diferencias apreciables en el número de linajes taxonómicos procarióticos (Fig. 3a) y no fueron significativas (p> 0,05, Kruskal-Wallis). Los detalles sobre las pruebas estadísticas mencionadas anteriormente están disponibles en la Tabla complementaria S7.

a Comparación de fracciones de tamaño de agua entera (>0,22 µm), 0,22–3 µm y 3–20 µm para el mismo volumen (10 L) y filtro (membrana plana), para MetaB16SV4V5 (izquierda) y metagenomas (derecha). Tenga en cuenta que los metagenomas no incluyeron muestras en una fracción de tamaño de 3 a 20 µm en (a). b Comparación de fracciones de tamaño (fracciones de tamaño de 0,22 a 3 µm, de 3 a 20 µm y > 20 µm) para el mismo volumen (100 L) y filtro (membrana plana), para MetaB16SV4V5 (izquierda) y metagenomas (derecha). Tenga en cuenta que los metagenomas no incluyeron muestras en una fracción de tamaño> 20 µm en (b). c Comparación entre membrana plana y membrana de cartucho, para el mismo volumen (10 L) y agua entera (>0,22 µm), para MetaB16SV4V5 (izquierda) y metagenomas (derecha). d Comparación entre 2,5 L (filtro único) y 10 L (cuatro filtros de 2,5 L agrupados), usando el mismo filtro (membrana de cartucho) y agua entera (> 0,22 µm), para MetaB16SV4V5 (izquierda) y metagenomas (derecha). Todos los paneles ilustran la riqueza de especies obtenida para cada muestra (punto). Para ayudar al lector a comparar las variables, agregamos diagramas de caja encima de los puntos. La significancia se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney para dos grupos independientes o Kruskall-Wallis para más de dos grupos independientes, seguida de una prueba de Dunn post hoc, si era necesario. La significación se ilustró con los símbolos: p > 0,05 (vacío); p < 0,05 (*); p < 0,01 (**); y p < 0,001 (***).

Siguiendo el mismo razonamiento, comparamos las fracciones de tamaño de 0,22–3 µm, 3–20 µm y >20 µm, utilizando el filtro de membrana plana, lo que reveló un aumento en la riqueza de especies procarióticas al aumentar el tamaño de los poros, tanto para MetaB16SV4V5 como para metagenomas. (Figura 3b). De hecho, el número medio de linajes taxonómicos procarióticos obtenidos por MetaB16SV4V5 aumentó significativamente de 335 (0,22–3 µm) a 429 (3–20 µm) y 538 (>20 µm) (p <0,05, Kruskal-Wallis, Fig. 3b ), más específicamente entre fracciones de tamaño de 0,22 a 3 µm y> 20 µm (p <0,05, prueba de Dunn post-hoc). De manera similar, los metagenomas aumentaron el número medio de linajes taxonómicos procarióticos de 155 (0,22 a 3 µm) a 195 (3 a 20 µm) (Fig. 3b), lo que también fue significativo (p <0,05, Mann-Whitney). Los detalles sobre las pruebas estadísticas mencionadas anteriormente están disponibles en la Tabla complementaria S7. Tenga en cuenta que para los metagenomas en la Fig. 3b no hay muestras para la fracción de tamaño> 20 µm porque algunas muestras se perdieron debido a ADN insuficiente para la secuenciación, mientras que algunas muestras que se secuenciaron con éxito se descartaron posteriormente debido al bajo número de lecturas (a continuación 10 000 lecturas; para obtener una lista de muestras descartadas en el paso de rarefacción, consulte la Tabla complementaria S4). La descripción general de la riqueza de especies procarióticas fue en general consistente y respaldada por las curvas de rarefacción porque las fracciones de diferentes tamaños tenían niveles similares de diversidad alfa, mientras que no se aplicaba lo mismo al volumen (Figuras complementarias S2 y S3).

Para verificar el efecto específico del filtro (membrana de cartucho o membrana plana), se compararon filtros para el mismo volumen (10 L) y tamaño de poro (agua entera, 0,22 µm) (Fig. 3c). El número de linajes taxonómicos procarióticos identificados por MetaB16SV4V5 fue mayor para el filtro de membrana de cartucho (Fig. 3c), pero esta diferencia no fue muy apreciable, porque el rango de valores para el filtro de membrana plana incluía casi todo el rango de valores del cartucho. filtro de membrana. Más específicamente, el número de linajes taxonómicos procarióticos obtenidos con el filtro de membrana plana osciló entre 297 y 372 (mediana = 314, IQR = 30, n = 5), mientras que para el filtro de membrana de cartucho, este número osciló entre 332 y 382 (mediana = 357, RIQ = 40, n = 4). En consecuencia, la diferencia entre el número de linajes taxonómicos procarióticos entre los filtros de cartucho y de membrana plana no fue significativa (p > 0,05, Mann-Whitney). Los metagenomas proporcionaron un número equivalente de linajes taxonómicos procarióticos entre cualquiera de los filtros (Fig. 3c) y las diferencias no fueron significativas (p> 0,05, Mann-Whitney). Aunque comparamos filtros de cartucho y de membrana plana en el mismo volumen (10 L), los filtros de membrana de cartucho alcanzaron los 10 L al combinar cuatro filtros de membrana de cartucho de 2,5 L. Sin embargo, el filtro de membrana de cartucho único de 2,5 L y el filtro de membrana de 10 L combinados de cuatro Los filtros de membrana de cartucho de 2,5 L obtuvieron un número equivalente de linajes taxonómicos procarióticos, sin diferencias significativas (p > 0,05, Mann-Whitney) para cualquiera de los enfoques de secuenciación (Fig. 3d). Los detalles sobre las pruebas estadísticas mencionadas anteriormente están disponibles en la Tabla complementaria S7.

Los resultados de diversidad alfa para toda la gama de volúmenes y fracciones de tamaño fueron consistentes con la diversidad beta. Para MetaB16SV4V5 y metagenomas, se agruparon muestras de agua entera y fracciones de tamaño de 0,22 a 3 µm en el análisis nMDS (Fig. 4a, b), seguidas de otros dos grupos distintos de muestras de 3 a 20 µm y >20 µm. fracciones de tamaño. Además, el volumen no siguió ninguna dirección clara en las figuras de ordenación (Fig. 4a, b). Se realizaron pruebas PERMANOVA para respaldar las cifras de ordenación, con resultados similares para MetaB16SV4V5 y metagenomas. Específicamente, tanto la fracción de volumen como la de tamaño cambiaron significativamente la composición de la comunidad (p < 0,05, PERMANOVA), pero este resultado debe interpretarse con cautela, porque si la misma prueba considera la división de muestras por fracción de tamaño, entonces la composición de la comunidad no cambió significativamente. en todo el volumen (p > 0,05, PERMANOVA). Los detalles sobre las pruebas estadísticas PERMANOVA para procariotas están disponibles en la Tabla complementaria S8. La variación dentro de las fracciones de tamaño, medida por la distancia al centroide, apoyó aún más la agrupación de la composición de la comunidad procariótica por fracciones de tamaño (Fig. 4c, d, Tabla complementaria S9).

Ordenación MDS de valores de disimilitud (Bray-Curtis) para la comunidad procariótica obtenida en cada muestra. Las muestras se colorearon por volumen y se agruparon por fracciones de tamaño de agua entera (>0,22 µm), 0,22–3 µm, 3–20 µm y >20 µm. División por (a) MetaB16SV4V5 y (b) metagenomas. Además, los diagramas de caja representan la distancia a los centroides de las muestras dentro de cada fracción de tamaño, dividida por (c) MetaB16SV4V5 y (d) metagenomas. Tenga en cuenta que los metagenomas no incluían la fracción de tamaño> 20 µm. Para obtener detalles sobre las réplicas faltantes, remitimos al lector a la Tabla complementaria S1.

Los antiguos patrones de diversidad alfa y beta podrían ser el reflejo de un grupo restringido de taxones dominantes, en lugar de toda la comunidad microbiana. Para verificar posibles diferencias debido a la taxonomía, se comparó el número de linajes taxonómicos para cada grupo taxonómico procariótico (ver Materiales y métodos) con las fracciones de volumen y tamaño (Fig. 5). Esta comparación reveló que las fracciones de tamaño, y no el volumen, afectaron la riqueza de especies dentro de los grupos taxonómicos de alto nivel, ya sea para MetaB16SV4V5 (Fig. 5) o metagenomas (Fig. Suplementaria S4). Un análisis más detallado reveló que la riqueza de especies procariotas en todo el volumen cambió de manera diferente dependiendo de la fracción de tamaño, como fue el caso de algunos grupos principales (Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Bacteroidetes, Deltaproteobacteria, Acidobacteria y Plantcomycetes) (Fig. 5). Aunque los metagenomas presentaron menos grupos taxonómicos a nivel de filo y clase, la mayoría se separaron consistentemente por fracción de tamaño en todos los volúmenes, como Gammaproteobacteria y Alphaproteobacteria, pero algunos no, como Betaproteobacteria y Thaumarchaeota (Figura complementaria S4). Tenga en cuenta que analizamos la riqueza de especies dentro de los grupos taxonómicos seleccionados y no su abundancia relativa. Para ilustrar la diferencia, trazamos el número de linajes taxonómicos atribuidos a Candidatus Marinimicrobia y su abundancia relativa para cada fracción de tamaño en 100 L de volumen (Fig. 6). El ejemplo del filo candidato Marinimicrobia muestra que, aunque no cambió el número de linajes taxonómicos (Fig. 6a), su abundancia relativa disminuyó al aumentar el tamaño de los poros de las fracciones de tamaño (Fig. 6b). Es posible que existan diferencias más finas en niveles taxonómicos inferiores para otros filos, pero el análisis completo de tales posibilidades va más allá del alcance de este estudio.

Cada panel representa la riqueza de especies de un filo o clase procariótica específica para cada volumen (1–1000 L). Los gráficos de barras indican la riqueza de especies y están coloreados según el tamaño de los poros. El grupo taxonómico denominado “Otros” incluye todos los filos que no alcanzaron, al menos, 100 linajes taxonómicos en todas las muestras, para evitar una cantidad excesiva de paneles redundantes y poco informativos. El grupo taxonómico denominado “Filo candidato” incluye todos los filos con designación de candidato, excepto el filo candidato Marinimicrobia.

a Número de linajes taxonómicos de filos Marinimicrobia candidatos y (b) abundancia relativa de los linajes taxonómicos de (a). Los valores de (a) y (b) se compararon para cada fracción de tamaño (0,22–3 µm, 3–20 µm y> 20 µm) utilizando el mismo volumen (100 L) y filtro (membrana plana).

Generalmente, la riqueza de especies de protistas se vio más afectada por el tamaño de los poros y por la utilización de filtros consecutivos que por el volumen (Fig. 7). Más específicamente, sólo la filtración total de agua (>0,22 µm) para MetaB18SV9 mostró algún cambio apreciable en la riqueza de especies de protistas de 2,5 L (mediana = 343, IQR = 6,75, n = 4) a 10 L (mediana = 348, IQR = 34,8 , n = 12) (Figura 7). Sin embargo, tanto para MetaB18SV9 como para los metagenomas, no hubo una diferencia apreciable en la riqueza de especies de protistas de 10 L a 1000 L, dentro de cualquiera de las fracciones de tamaño (Fig. 7). Al comparar los tamaños de poro, las fracciones de tamaño de agua entera (>0,22 µm), 3–20 µm y >20 µm identificaron más linajes taxonómicos de protistas que las muestras de fracciones de tamaño de 0,22–3 µm (Fig. 7). El número de linajes taxonómicos de protistas obtenidos después de cada muestra está disponible en la Tabla complementaria S10. El mayor impacto de la fracción de tamaño, en lugar del volumen, en la riqueza de especies de protistas fue respaldado aún más por las curvas de rarefacción (Figuras complementarias S2 y S3), a pesar de que las fracciones de tamaño no eran tan distintas entre sí como lo eran con los datos procarióticos.

La cuadrícula divide las posibles estrategias de secuenciación en filas (MetaB18SV9 o metagenoma) y la utilización de agua entera (>0,22 µm) o fracciones de tamaño (0,22–3 µm, 3–20 µm y >20 µm) en columnas. El color distingue entre filtros de membrana plana y de cartucho. Dentro de cada unidad de cuadrícula, la riqueza de especies de protistas se traza en función del volumen. Para obtener detalles sobre las réplicas faltantes, remitimos al lector a la Tabla complementaria S1.

Para verificar el impacto del uso de agua entera o fracciones de tamaño, comparamos estas muestras para el mismo volumen (10 L) y filtro (membrana plana). Tanto MetaB18SV9 como los metagenomas tenían menos linajes taxonómicos de protistas en la fracción de tamaño de 0,22 a 3 µm que en toda el agua (>0,22 µm) o en la fracción de tamaño de 3 a 20 µm (Fig. 8a). Sin embargo, el rango del número de linajes taxonómicos de protistas obtenidos para agua entera incluyó el rango de valores para las fracciones de tamaño de 0,22 a 3 µm y de 3 a 20 µm (Fig. 8a). Más específicamente, el número de linajes taxonómicos de protistas obtenidos por MetaB18SV9 varió entre 290 y 380 para toda el agua, 289 y 338 para una fracción de tamaño de 0,22 a 3 µm y de 338 a 357 en fracciones de tamaño de 3 a 20 µm (Fig. 8a). que no fueron significativamente diferentes (p > 0,05, Kruskal-Wallis). El número de linajes taxonómicos de protistas obtenidos por metagenomas varió entre 88 y 129 para agua entera, 91 y 97 para fracciones de tamaño de 0,22 a 3 µm, y 105 y 128 para fracciones de tamaño de 3 a 20 µm (Fig. 8a); estas diferencias tampoco fueron estadísticamente significativas (p > 0,05, Kruskal-Wallis). Sin embargo, observamos que el número de muestras para el metagenoma proporciona poco apoyo para las diferencias descritas en esta comparación específica. Los detalles sobre las pruebas estadísticas mencionadas anteriormente están disponibles en la Tabla complementaria S11.

a Comparación de fracciones de tamaño de agua entera (>0,22 µm), 0,22–3 µm y 3–20 µm para el mismo volumen (10 L) y filtro (membrana), para MetaB18SV9 (izquierda) y metagenomas (derecha). b Comparación de fracciones de tamaño (fracciones de tamaño de 0,22 a 3 µm, de 3 a 20 µm y > 20 µm) para el mismo volumen (100 L) y filtro (membrana), para MetaB18SV9 (izquierda) y metagenomas (derecha). c Comparación entre membrana plana y membrana de cartucho, para el mismo volumen (10 L) y agua entera (>0,22 µm), para MetaB18SV9 (izquierda) y metagenomas (derecha). d Comparación entre 2,5 L (filtro único) y 10 L (cuatro filtros de 2,5 L agrupados), usando el mismo filtro (membrana de cartucho) y agua entera (> 0,22 µm), para MetaB18SV9 (izquierda) y metagenomas (derecha). Todos los paneles ilustran la riqueza de especies obtenida para cada muestra (punto). Para ayudar al lector a comparar las variables, agregamos diagramas de caja encima de los puntos. La significancia se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney para dos grupos independientes o Kruskall-Wallis para más de dos grupos independientes, seguida de una prueba de Dunn post hoc, si era necesario. La significación se ilustró con los símbolos: p > 0,05 (vacío); p < 0,05 (*); p < 0,01 (**); y p < 0,001 (***).

Comparando directamente las fracciones de tamaño de 0,22–3 µm, 3–20 µm y >20 µm para el mismo filtro (membrana) y volumen (100 L), la fracción de tamaño de 0,22–3 µm tenía menos linajes taxonómicos de protistas que los 3 Fracciones de tamaño de –20 µm y> 20 µm (Fig. 8b), tanto para MetaB18SV9 como para metagenomas. Estas diferencias fueron significativas para MetaB18SV9 (p <0,05, Kruskal-Wallis), pero no para los metagenomas (p > 0,05, Kruskal-Wallis). Sin embargo, la significancia de la prueba no fue muy fuerte y la prueba post hoc para MetaB18SV9 no fue significativa para ninguna combinación de fracciones de tamaño, después del ajuste (p > 0,05, prueba post hoc de Dunn). Los detalles sobre las pruebas estadísticas mencionadas anteriormente están disponibles en la Tabla complementaria S11.

Para verificar el efecto específico del tipo de filtro, se compararon filtros de cartucho y de membrana plana para el mismo volumen (10 L) y tamaño de poro (agua entera, >0,22 µm). Las diferencias en el número de linajes taxonómicos de protistas entre los filtros de cartucho y de membrana plana fueron pequeñas (Fig. 8c) y no significativas (p > 0,05, Mann-Whitney). Sin embargo, el rango de valores fue más amplio para el filtro de membrana plana que para el filtro de membrana de cartucho con el enfoque MetaB18SV9 (Fig. 8c). El número de linajes taxonómicos de protistas dentro de las réplicas de filtros de membrana plana varió entre 290 y 380 (diferencia de 90 linajes taxonómicos), mientras que en los filtros de membrana de cartucho varió entre 354 y 373 (diferencia de 19 linajes taxonómicos) (Fig. 8c). Para los metagenomas, los valores fueron equivalentes entre ambos tipos de filtros (Fig. 8c). Tenga en cuenta que los filtros de membrana de cartucho y de membrana plana se compararon con un volumen de 10 L, pero las muestras de membrana de cartucho obtuvieron 10 L al combinar cuatro filtros de membrana de cartucho de 2,5 L. Para MetaB18SV9, el número de linajes taxonómicos de protistas obtenidos después de combinar cuatro filtros de membrana de cartucho de 2,5 L fue mayor que el uso de un solo filtro de 2,5 L (Fig. 8d), pero no fue significativo (p > 0,05, Mann-Whitney). Sin embargo, esto no fue lo mismo para los metagenomas, donde el número de linajes taxonómicos de protistas fue equivalente y ligeramente mayor para un solo filtro de 2,5 L (Fig. 8d), pero tampoco significativo (p > 0,05, Mann-Whitney). Los detalles sobre las pruebas estadísticas mencionadas anteriormente están disponibles en la Tabla complementaria S11.

La diversidad beta fue consistente con la riqueza de especies, porque las muestras se agruparon según el tamaño de los poros del filtro (Fig. 9a, b). Las muestras de tamaños de poro más pequeños (agua entera, 0,22–3 µm y 3–20 µm) estaban cerca unas de otras, mientras que las muestras para fracciones de tamaño >20 µm estaban distantes del resto, ya sea en MetaB18SV9 y en metagenomas (Fig. 9a, b). ). Esto fue respaldado aún más por los resultados significativos de PERMANOVA para las fracciones de volumen y tamaño de forma independiente (p <0,05, PERMANOVA), pero una vez que se consideraron en conjunto, el efecto sobre la composición de la comunidad ya no fue significativo (p > 0,05, PERMANOVA). Tenga en cuenta que la variable para fracciones de tamaño no cumplió con el requisito previo de homogeneidad de varianza de PERMANOVA (p > 0,05, betadisper). Los detalles sobre las pruebas estadísticas PERMANOVA para protistas están disponibles en la Tabla complementaria S12. Además, una mirada más detallada a los resultados del betadisper, es decir, una medida de la distancia al centroide de las muestras dentro de cada fracción de tamaño, reveló que las muestras eran muy consistentes dentro de las fracciones de tamaño (Fig. 9c, d y Tabla complementaria S13).

Ordenación MDS de valores de disimilitud (Bray-Curtis) para la comunidad protista obtenida en cada muestra. Las muestras se colorearon por volumen y se agruparon por fracciones de tamaño de agua entera (>0,22 µm), 0,22–3 µm, 3–20 µm y >20 µm divididas por (a) MetaB18SV9 y (b) metagenomas. Además, los diagramas de caja representan la distancia a los centroides de las muestras dentro de cada fracción de tamaño, dividida por (c) MetaB16SV4V5 y (d) metagenomas.

El análisis taxonómico de MetaB18SV9 no reveló relaciones claras entre el número de linajes taxonómicos de protistas y el volumen, aunque algunos grupos como Dinophyceae sí mostraron un pequeño aumento en su riqueza de especies al aumentar el volumen (Fig. 10). Para varios grupos taxonómicos de protistas, la fracción de tamaño >20 µm identificó consistentemente más linajes taxonómicos, independientemente del volumen, por ejemplo, Dinophyceae, Bacillariophyceae y Foraminifera (Fig. 10). En contraste, otros grupos fueron más prevalentes en la fracción de tamaño de 3 a 20 µm, como Cercozoa, Hacrobia y Haptophyta (Fig. 10). Varios grupos no parecieron favorecer ninguna fracción de tamaño específica, como Excavata o Syndinales (Fig. 10). En los metagenomas, de 10 L a 1000 L, algunos grupos tenían más linajes taxonómicos de protistas en la fracción de tamaño> 20 µm, como Bacillariophyceae, o menos, como Hacrobia (Figura complementaria S5). Además, los metagenomas no revelaron ningún grupo taxonómico específico que aumentara el número de linajes taxonómicos de protistas con un volumen creciente (Figura complementaria S5).

Cada panel representa la riqueza de especies de un grupo de protistas específico para cada volumen (1–1000 L). Los gráficos de barras indican la riqueza de especies y están coloreados según el tamaño de los poros. Los grupos taxonómicos seleccionados siguen una “clasificación falsa” seleccionada manualmente para resaltar los grupos de interés, y los grupos menos representativos se fusionan en la designación “Otros”.

Este estudio comparó directamente las metodologías de muestreo de agua de mar utilizadas en las principales campañas de muestreo del océano global en busca de microorganismos marinos: Tara Oceans [10], Malaspina [9], Ocean Sampling Day [13] y European Marine Omics Biodiversity Observation Network [16]. Nuestra intercomparativa incluye filtros de cartucho y de membrana plana, por filtración total de agua (filtro único), o por fraccionamiento por tamaño (filtración de agua en serie de tres filtros de diferentes tamaños de poro). Los volúmenes filtrados a través de filtros de membrana de cartucho oscilaron entre 1 L y 2,5 L, con una muestra adicional de 10 L resultante de combinar 4 muestras de 2,5 L. Este paso de combinación es una práctica común en varios laboratorios, ya que los filtros de membrana de cartucho no son prácticos para grandes cantidades. volúmenes de agua de mar [62]. Dichos estudios requieren el uso de filtros de membrana plana, que en nuestro caso sirvieron para filtrar de 10 L a 100 L, y para agrupar muestras de 100 L en volúmenes aún mayores, hasta 1000 L.

Nuestros resultados mostraron claramente que el tamaño de los poros fue la única variable metodológica que afectó significativamente la descripción de las comunidades microbianas en términos de diversidad alfa y beta. Esto fue más evidente para los protistas, como se esperaba [39, 40], y sustenta la razón por la cual algunas expediciones, como Tara Oceans, utilizaron fraccionamiento por tamaño [63]. Además, los estudios han demostrado que los pasos de prefiltración y las fracciones de tamaño, de hecho, cambian la percepción de la diversidad microbiana [39, 64]. Desde un punto de vista taxonómico, la mayoría de los grupos taxonómicos podrían identificarse en todas las fracciones de tamaño. Esto fue más sorprendente para los procariotas, donde la fracción de tamaño >20 µm tenía consistentemente más linajes taxonómicos, lo que indica que se encontraron específicamente varios linajes taxonómicos en esa fracción de tamaño. Una posible explicación para la identificación de linajes taxonómicos específicos de la fracción de tamaño >20 µm es que esos procariotas estaban adheridos a partículas o al propio material del filtro. Teniendo en cuenta que la turbidez del agua era muy baja, las únicas partículas a las que los procariotas podrían adherirse serían los protistas u otros restos celulares, incluidos los agregados. Por lo tanto, sugerimos que los linajes taxonómicos procarióticos específicos de la fracción de gran tamaño podrían ser procariotas asociados con microeucariotas, bacterias coloniales y/o especializadas en colonizar partículas más grandes. Dada la presencia de procariotas en fracciones de tamaño > 20 µm y protistas en fracciones de tamaño de 0,22 a 3 µm, no podemos descartar la posibilidad de que el ADN extracelular, además de las células reales, se retenga en los filtros, por ejemplo, mediante sorción [64]. Sin embargo, el panorama general es que los procariotas de vida libre se identifican de manera idéntica en agua entera (> 0,22 µm) y en fracciones de tamaño de 0,22–3 µm, mientras que los procariotas adheridos a partículas pueden retenerse dentro de fracciones de tamaño de poro más grande (3–20 µm y > 20 µm). Esto es consistente con estudios previos que explican el efecto de la prefiltración sobre la diversidad procariótica con la secuenciación del gen 16 S rRNA [65]. Los protistas también siguen el mismo cuadro general descrito en estudios anteriores [40], con contaminación entre fracciones de menor tamaño, por ejemplo, debido a fragmentos celulares. En este estudio, cualquiera de los grupos biológicos fue el más singular en composición con una fracción de tamaño >20 µm. No obstante, destacamos que fue inesperado encontrar más linajes taxonómicos procarióticos y protistas en la fracción de tamaño > 20 µm que en agua entera, lo que no puede explicarse completamente por nuestro diseño experimental y debe abordarse en trabajos futuros.

Los patrones relacionados con el tamaño de los poros fueron independientes del volumen filtrado. De hecho, nuestro trabajo demuestra que el volumen de agua filtrada no afecta la riqueza de especies y la diversidad beta de la muestra analizada. En otras palabras, recolectar más agua, es decir, más células, no se tradujo en más linajes taxonómicos procarióticos o protistas, ni en variaciones significativas en la disimilitud de la comunidad o en diferentes composiciones taxonómicas de alto nivel. Además, cabe destacar que comparamos 1 L con 10 L después de la filtración completa mediante membrana de cartucho y 10 L con 1000 L después del fraccionamiento por tamaño mediante tres filtros de membrana plana consecutivos, lo que supera con creces los volúmenes filtrados en la mayoría de los estudios ecológicos microbianos marinos. (generalmente hasta 100 L, por ejemplo, [7]), y es un rango más alto que estudios previos sobre el efecto del volumen filtrado y la prefiltración [65]. Con respecto a la utilización de membrana de cartucho con 2,5 L o 10 L como resultado de agrupar 4 muestras de 2,5 L, las métricas de diversidad utilizadas fueron similares y las diferencias en la composición de la comunidad fueron cercanas a cero. Sin embargo, para grupos taxonómicos específicos, la regla general no necesariamente se aplica. Por ejemplo, el número de linajes taxonómicos atribuidos a Dinophyceae aumentó con el volumen, aunque fue un aumento pequeño.

En general, podemos argumentar que, excepto por el tamaño de los poros, hay poca o ninguna diferencia entre los protocolos y que las pequeñas diferencias pueden deberse a eventos estocásticos. No obstante, observamos que nuestro análisis se basó principalmente en estimaciones cuantitativas de la diversidad y en situaciones específicas, según el diseño y la pregunta del estudio, diferencias aparentemente sin importancia desde un punto de vista cuantitativo podrían ser relevantes. Por ejemplo, si el objetivo se centrara en el filo candidato Marinimicrobia, que es abundante en varios ambientes marinos y puede desempeñar funciones en los ciclos biogeoquímicos marinos [66], podría ser relevante saber que si bien podemos obtener un número similar de especies taxonómicas linajes para cada fracción de tamaño, su abundancia relativa disminuye con la fracción de tamaño. Desconocemos el mecanismo para justificar la mayor abundancia relativa del filo candidato Marinimicrobia en una fracción de tamaño de 0,22 a 3 µm. A pesar de eso, esperábamos encontrar miembros más abundantes de este filo candidato en metagenomas, según trabajos previos que compararon la secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA y metagenomas de muestras de agua de mar del Ártico [67]. En cambio, el filo candidato Marinimicrobia era raro en los datos del metagenoma (abundancia relativa inferior al 0,1%). Además de este ejemplo particular, no exploramos más la taxonomía, dejando este desafío para futuras investigaciones.

En este estudio, comparamos las variaciones de protocolo mencionadas anteriormente en el muestreo de agua de mar con distintas estrategias de secuenciación. Específicamente, la secuenciación de amplicones de las regiones hipervariables V4-V5 del gen 16 S rRNA y de la región hipervariable V9 del gen 18 S rRNA, basada en cebadores bien establecidos [22, 42,43,44,45]. También se incluyó la secuenciación de ADN total, que es un enfoque no dirigido a genes que carece de un paso de amplificación y, por lo tanto, da como resultado un número menor de lecturas de genes individuales que pueden usarse para determinar la diversidad microbiana, pero no se ve afectado por el sesgo del cebador, por ejemplo, Brown. et al. [68]. Los linajes taxonómicos derivados del metagenoma se dividieron en procariotas y protistas. Aunque los análisis se realizaron de forma independiente para cada uno de los grupos mencionados anteriormente, pudimos ver que los resultados fueron consistentes entre las diferentes estrategias de secuenciación. La diferencia práctica estuvo en el número de linajes taxonómicos, que fue menor para procariotas y protistas bajo metagenomas, mientras que la diferencia relativa entre las variables metodológicas probadas fue similar. Pocas excepciones incluyen la comparación entre el uso de un solo filtro de 2,5 L o el uso de 10 L (4 filtros agrupados de 2,5 L), donde los enfoques basados ​​en amplicones identificaron más linajes taxonómicos en el enfoque combinado, mientras que los metagenomas identificaron más linajes taxonómicos en el filtro único. con 2,5 L. Sin embargo, observamos que las diferencias fueron pequeñas en ambas situaciones. En conjunto, está claro que las variables metodológicas plantean efectos similares sobre la riqueza de especies observadas y la diversidad beta independientemente de la estrategia de secuenciación. En cuanto a la taxonomía, los metagenomas obtuvieron una resolución más baja en el análisis de alto nivel que la obtenida con los enfoques basados ​​en amplicones, ya sea para procariotas o protistas. Esta menor resolución fue consecuencia de un menor número de lecturas del gen SSU en general, y no de ninguna de las variables metodológicas de muestreo analizadas. Esto se esperaba de estudios previos en los que se compararon muestras similares para enfoques basados ​​en amplicones y metagenomas, por ejemplo, [67].

Este conjunto de datos está disponible públicamente (consulte la sección Disponibilidad de datos) y contiene muestras de más variables metodológicas que las presentadas en este trabajo. Por ejemplo, no utilizamos las muestras de los resultados de la secuenciación de amplicones del gen 16 S rRNA divididos por la longitud de las lecturas en la etapa de preparación de la biblioteca. Otra variable que no consideramos fue la máquina secuenciadora (HiSeq o MiSeq). Un estudio reciente comparó réplicas de las plataformas HiSeq y MiSeq, después de la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA, y encontró diferencias en la composición de la comunidad [69]. Sin embargo, observamos que el estudio antes mencionado se centró en el microbioma del coral, mientras que el nuestro se centra en las comunidades microbianas del agua de mar.

Debido a la gran cantidad de variables diferentes probadas en este estudio, el conjunto de datos EMOSE tiene cientos de muestras, lo que es una ventaja significativa sobre los estudios actualizados, pero también tiene algunas limitaciones. En primer lugar, puede resultar complejo utilizar los datos disponibles debido al elevado número de variables. En segundo lugar, el elevado número de muestras es el resultado de muchas variables probadas, no de muchas réplicas (n = 3, siempre que sea posible). Sin embargo, cabe señalar que no fue posible mantener el mismo número de réplicas en todas las variables debido a imposibilidades metodológicas y logísticas in situ, incluido el esfuerzo y el tiempo necesarios para filtrar 100 litros de agua de mar utilizando tres filtros diferentes. Algunas limitaciones son aún más comprensibles si tenemos en cuenta el hecho de que, hasta donde sabemos, el conjunto de datos presentado evalúa el efecto de la filtración de varios miles de litros de agua de mar realizada por primera vez a tal escala durante un Campaña de un día/un solo lugar.

Decidimos comprometernos con un procedimiento de rarefacción tradicional y fácil de entender, pero somos conscientes de sus limitaciones y posibles implicaciones. Más específicamente, la rarefacción da como resultado la pérdida de lecturas válidas y de muestras válidas y no tiene en cuenta la naturaleza composicional de los datos de secuenciación de alto rendimiento [70, 71]. Además, otro estudio que comparó directamente las estrategias de muestreo de agua de mar sugirió no estandarizar los resultados de la secuenciación [34]. Algunas alternativas resuelven la normalización de datos compositivos sin la necesidad de eliminar lecturas válidas, por ejemplo, la transformación de relación logarítmica centrada [71]. Sin embargo, los procedimientos de normalización alternativos pueden dificultar la interpretación, por ejemplo, al dar valores negativos de diversidad, y pueden ser más difíciles de entender que la rarefacción, que es una práctica común entre pares y relativamente fácil de interpretar. También observamos que las diferencias en la profundidad de secuenciación entre muestras fueron considerablemente grandes en algunos casos y no existe una única "mejor" herramienta de normalización para resolver ese problema.

En cuanto al análisis estadístico de riqueza de especies, utilizamos pruebas no paramétricas que comparan distribuciones y, por tanto, deben ir acompañadas de información de mediana e intercuartil, que ilustramos mediante diagramas de caja. Aunque se utilizaron pocas réplicas en algunas comparaciones, lo que compromete la confianza en las distribuciones de datos [72], nuestros análisis demuestran claramente el impacto del fraccionamiento por tamaño en la riqueza de especies tanto para los datos de secuenciación de metagenomas como de amplicones. Además, reconocemos que el uso de una única métrica de diversidad alfa (riqueza de especies) podría pasar por alto algunas tendencias de los datos; creemos que este no sería el caso para el índice de Shannon, pero podría serlo para el índice de Simpson basado en el análisis de correlación (Suplementario). Figura S1).

Además de la innegable importancia científica, la investigación presentada también tiene un importante significado práctico. Teniendo en cuenta nuestros resultados, especialmente en el caso de investigaciones que, debido a recursos y tiempo limitados, no pueden permitirse filtrar grandes volúmenes de agua de mar, recomendamos la filtración parcial. Como demostramos, dividir los esfuerzos de filtrar, entre otras cosas, 1000 L en 100 muestras de 10 L (que podrían dividirse en docenas de réplicas para cada variable), aún representa con precisión el sitio en cuestión y no afecta negativamente el poder estadístico. de las pruebas. En comparación con, por ejemplo, dos muestras de 500 litros cada una, no se produciría ninguna mejora en la biodiversidad reconocida y el análisis estadístico se vería comprometido. Es importante destacar que la naturaleza aplicativa de esta recomendación se refiere principalmente a estudios centrados en aspectos de la diversidad microbiana del agua de mar. Para estudios con otros objetivos, el razonamiento podría no aplicarse o aplicarse de manera diferente.

Nuestros hallazgos resaltan que los diferentes volúmenes de muestra de agua de mar (de 1 L a 1000 L) y los tipos de filtros no afectaron la riqueza de especies de procariotas y protistas identificadas ni la diversidad beta. En cambio, mediante filtración seriada con membranas de diferentes tamaños de poro, el fraccionamiento por tamaño fue un factor crucial para los resultados obtenidos. Además, el uso de filtración de agua total (>0,22 µm) fue generalmente equivalente a la fracción de tamaño de 0,22 a 3 µm. Este metacódigo de barras y comparación metagenómica de protocolos de muestreo puede ayudar a los investigadores a diseñar sus propias campañas de muestreo y comparar estudios que utilizan diferentes protocolos. Aunque hicimos un tremendo esfuerzo para abordar muchas variables diferentes en los protocolos utilizados por diferentes campañas, hay más que probar y comparar con el fin de estandarizar los protocolos en el futuro, por ejemplo, los protocolos de extracción de ADN.

Todas las secuencias sin procesar del conjunto de datos EMOSE, que incluye todos los datos utilizados en este artículo, están disponibles en el Archivo Europeo de Nucleótidos con el número de acceso ERP090011. Las tablas de abundancia están disponibles en la plataforma MGnify con el número de acceso MGYS00001935. Tenga en cuenta que tanto la versión 5 como la 4.1 incluyen todas las estrategias de secuenciación (MetaB16SV4V5, MetaB18SV9 y metagenomas). Los metadatos de cada base de datos de muestra se registraron en PANGEA [71], pero hay una versión más limpia disponible en la Tabla complementaria S2. Los scripts R para toda la manipulación de datos, pruebas estadísticas y cifras están disponibles en github (https://github.com/pascoalf/Inter-comparison-of-marine-microbiome-sampling-protocols), no se realizó ninguna manipulación de datos fuera del Se proporcionan scripts, excepto para la curación manual de taxonomía, porque necesita la evaluación de expertos humanos.

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Agradecemos al capitán y a la tripulación del RV 'Nereis II' su ayuda en la adquisición de las muestras en el Observatorio Oceanográfico de Banyuls. Agradecemos a Ana Gomes por ayudar con el diseño de la Fig. 1. Agradecemos a David Needham por su valioso asesoramiento sobre bioinformática.

Este estudio fue apoyado por la Red Europea de Investigación Marina Euromarine mediante la financiación de la iniciativa EMOSE 2017 “Intercomparación de métodos de análisis del metagenoma del plancton marino”. La Fundación Portuguesa de Ciencia y Tecnología (FCT) financió este estudio a través de las subvenciones PTDC/CTA-AMB/4946/2020, 2022.02983.PTDC, 2020.03139 CEECIND a CM y una beca de doctorado a FP (2020.04453). El trabajo de LT se llevó a cabo, en parte, gracias a la financiación del programa Canada Research Chairs y a una Discovery Grant del NSERC. Este estudio también fue financiado parcialmente por el Fondo Estratégico UIDP/04423/2020, UIDB/04565/2020 y LA/P/0140/2020 a través de fondos nacionales proporcionados por FCT y llevado a cabo bajo los proyectos ATLANTIDA (ref. NORTE-01–0145 -FEDER-000040) y Ocean3R (NORTE-01-0145-FEDER-000064), apoyados por el Programa Operativo Regional Norte de Portugal (NORTE 2020), en el marco del Acuerdo de Asociación PORTUGAL 2020 y a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Este trabajo también fue financiado parcialmente por la financiación atribuida a TT de la Agencia de Investigación de Eslovenia (Research Core Funding P1-0237).

Centro Interdisciplinario de Investigaciones Marinas y Ambientales, Universidad de Oporto, Terminal de Cruceros de Porto de Leixões, Av. General Norton de Matos s/n, 4450-208, Oporto, Portugal

Francisco Pascoal, María Paola Tomasino y Catarina Magalhães

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Oporto, Rua do Campo Alegre s/n, 4169– 007, Oporto, Portugal

Francisco Pascoal y Catarina Magalhães

Departamento de Ecología Marina Integrativa, Stazione Zoologica Anton Dohrn, Nápoles, Italia

Roberta Piredda

Instituto de Recursos Biológicos y Biotecnologías Marinas, Consejo Nacional de Investigación (IRBIM-CNR), Largo Fiera della Pesca 2, 60125, Ancona, Italia

Grazia Marina Quero

Facultad de Ciencias de la Computación, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

Luis Torgo

Genómica metabólica, genoscopio, Instituto François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Université Paris-Saclay, 2 Rue Gaston Crémieux, 91057, Evry, Francia

Julie Poulain

Universidad de la Sorbona, CNRS, Laboratorio de Ecogeoquímica de Ambientes Bentónicos (LECOB), Observatorio Oceanológico de Banyuls, Banyuls-sur-Mer, Francia

Pierre E. Galand

Biología Marina y Ambiental, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad del Sur de California (USC), Los Ángeles, CA, EE. UU.

Jed A. Fuhrman

Instituto Europeo de Bioinformática del EMBL (EMBL-EBI), Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SD, Reino Unido

Alex Mitchell y Stéphane Pesant

Instituto Nacional de Biología, Estación de Biología Marina Piran, Piran, Eslovenia

Tinkara Tinta & Timotej Turk Dermastia

Centro de GeoGenetica de la Fundación Lundbeck, Instituto GLOBE, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Antonio Fernandez-Guerra

Departamento de Biología, Universidad de Padua, Via U. Bassi 58/B, 35131, Padua, Italia

Alessandro Vezzi y Fabio De Pascale

Institute of Marine Sciences (ICM), CSIC. Paseo Marítimo de la Barceloneta, 37-49, ES08003, Barcelona, ​​Spain

Ramiro Logares & Pablo Sánchez

Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Trieste, Trieste, Italia

francesca malfatti

Centro de Bioinformática, Instituto de Investigación Química, Universidad de Kyoto, Gokasho, Uji, Japón

Endo Hisashi

Departamento de Ecología Marina, Instituto de Oceanología Academia Polaca de Ciencias, Sopot, Polonia

Anna María Dąbrowska

Universidad de la Sorbona, CNRS, Estación Biológica de Roscoff, AD2M ECOMAP, UMR 7144, Roscoff, Francia

Nicolás Enrique

CNRS, FR2424, ABiMS, Estación Biológica Roscoff, Universidad de la Sorbona, Roscoff, Francia

Nicolás Enrique

Departamento de Biociencias, Biotecnologías y Medio Ambiente, Universidad de Bari, 70126, Bari, Italia

Bruno Fosso

Departamento de Biología, Estación de Campo John Krebs, Universidad de Oxford, Wytham, OX2 8QJ, Reino Unido

Bryan Wilson

Centro Kurchatov para la Investigación del Genoma, Moscú, Rusia

Stephan Toshchakov

Investigación e Innovación, Matís, Reykjavík, Islandia

Gregorio Kevin Ferrant

Universidad Técnica de Dinamarca, Instituto Nacional de Recursos Acuáticos, Kgs. Lyngby, Dinamarca

Ivo Grigórov

Departamento de Biología, École Normale Supérieure, París, Francia

Fabio Rocha Jiménez Vieira

Departamento de Bioingeniería, Instituto Superior Técnico, Universidad de Lisboa, Av. Rovisco Pais, 1049-001, Lisboa, Portugal

Rodrigo Costa

Instituto de Bioingeniería y Biociencias (iBB) e i4HB—Instituto de Salud y Bioeconomía, Instituto Superior Técnico, Universidad de Lisboa, Av. Rovisco País, 1049-001, Lisboa, Portugal

Rodrigo Costa

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FP, RC, LT y CM conceptualizaron el artículo. FP escribió el manuscrito y el script R para todos los análisis estadísticos y visualización de datos. LT y RP contribuyeron al análisis estadístico y la visualización de datos. Taxonomía de protistas curada por RP. SP, CM, MPT, AV y FM fueron responsables del diseño de la campaña de muestreo EMOSE. CM, MPT y SP fueron responsables del muestreo de agua de mar. CM y JP fueron responsables de la extracción, amplificación y secuenciación del ADN. CM, SP y JP fueron responsables de la disponibilidad pública de los datos de EMOSE. AMD, AM, BW, MPT, RP, GMQ, JP, PEG, TT, TTD, AFG, AV, RL, FM, HE, FDP, PS, NH, RC, JAF y CM contribuyeron al texto/editaron el manuscrito . CM, MPT, SP, RP, GMQ, JP, PEG, JAF, TT, TTD, AFG, AV, RL, FM, HE, AMD, FDP, PS, NH, AM, BF, BW, ST, GKF, IG, y FRJV contribuyó al análisis preliminar de datos y a la formulación de las preguntas científicas.

Correspondencia a Stéphane Pesant o Catarina Magalhães.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Pascoal, F., Tomasino, MP, Piredda, R. et al. Intercomparación de protocolos de muestreo de microbiomas marinos. COMUN ISME. 3, 84 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00278-w

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Recibido: 31 de enero de 2023

Revisado: 19 de junio de 2023

Aceptado: 23 de junio de 2023

Publicado: 19 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00278-w

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